Kiểm tra Catalase: nền tảng, kỹ thuật và sử dụng
Xét nghiệm catalase là một phương pháp được sử dụng trong các phòng thí nghiệm vi khuẩn học để chứng minh sự hiện diện của enzyme catalase trong những vi khuẩn sở hữu nó. Cùng với màu Gram là các thử nghiệm chính nên được thực hiện trên các vi sinh vật mới được phân lập. Các xét nghiệm này hướng dẫn các nhà vi trùng học về các bước cần tuân thủ để xác định chính xác vi sinh vật trong câu hỏi.
Nói chung, vi khuẩn chứa cytochrom sở hữu enzyme catalase, nghĩa là vi khuẩn kỵ khí hiếu khí và kỵ khí nên sở hữu nó. Tuy nhiên, có những trường hợp ngoại lệ, chẳng hạn như Streptococcus, mặc dù là vi sinh vật kỵ khí tùy tiện không sở hữu enzyme catalase.
Đó là lý do tại sao xét nghiệm catalase được sử dụng chủ yếu để phân biệt các họ Staphylococaceae và Micrococaceae (cả catalase dương tính) của họ Streptococaceae (catalase âm tính).
Tương tự, chi Bacillus (catalase dương tính) được phân biệt với chi Clostridium (catalase âm tính), trong số những người khác.
Nền tảng
Catalase là một loại enzyme được phân loại là hydroperoxidase, điều này có nghĩa là chúng sử dụng hydro peroxide (H 2 O 2 ) làm cơ chất.
Nó cũng được coi là một oxyoreductase, vì trong phản ứng có một nguyên tố đóng vai trò là chất cho điện tử (chất khử) và chất khác là thụ thể điện tử (chất oxy hóa).
Catalase là một loại protein có chứa một nhóm chân giả với bốn nguyên tử sắt hóa trị ba (Fe +++), do đó nó là một homoprotein. Các ion sắt vẫn bị oxy hóa trong phản ứng.
Có thể nói rằng catalase là một loại enzyme giải độc, vì chức năng của nó là loại bỏ các chất được tạo ra trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn gây độc cho vi khuẩn. Trong số các chất này là hydro peroxide.
Hydrogen peroxide được hình thành từ sự phân hủy đường bằng con đường hiếu khí. Quá trình này xảy ra như sau:
Ion superoxide (O 2 -) (gốc tự do) được hình thành như là sản phẩm cuối cùng của quá trình đồng hóa glucose bằng con đường hiếu khí. Điều này là độc hại và được loại bỏ bởi enzyme superoxide effutase biến đổi nó thành khí oxy và hydro peroxide.
Hydrogen peroxide cũng độc hại với vi khuẩn và cần được loại bỏ. Enzym catalase mở ra hydro peroxide trong nước và oxy.
Catalase có thể hoạt động trên các chất nền khác ngoài hydro peroxide, chẳng hạn như rượu, aldehyd, axit, amin thơm và phenol. Tuy nhiên, hydro peroxide cũng có thể được sử dụng bởi catalase để oxy hóa các hợp chất độc hại khác như rượu methyl và ethyl.
Tương tự như vậy, catalase có trong các tế bào thực bào, bảo vệ nó khỏi tác động độc hại của hydro peroxide.
Kỹ thuật thường quy cho xét nghiệm catalase
Phương pháp -Oject
Vật liệu
3% hydro peroxide (10 tập).
Kính trượt
Tay cầm bằng nhựa dùng một lần hoặc thanh gỗ.
Thủ tục
Lấy đủ thuộc địa để nghiên cứu mà không cần chạm vào môi trường thạch nơi nó đến. Thuộc địa phải tươi, nghĩa là, từ một nền văn hóa từ 18 đến 24 giờ.
Đặt thuộc địa trên phiến khô và trên đó thêm một giọt 3% hydro peroxide (cũng có thể sử dụng 30% H 2 O 2 ). Quan sát ngay lập tức nếu bong bóng được phát hành hay không.
Giải thích
Phản ứng tích cực: tiến hóa khí, được chứng minh bằng sự hình thành bong bóng (sủi bọt mạnh).
Phản ứng tiêu cực: không có sự hình thành bong bóng.
- Phương pháp trực tiếp trong văn hóa thuần túy
Đặt 1 ml 3% H 2 O 2 trên môi trường nuôi cấy tinh khiết trong các đĩa hoặc nêm không chứa máu (tốt nhất là thạch dinh dưỡng). Quan sát xem sự hình thành bong bóng tồn tại ngay lập tức. Bạn cũng có thể sử dụng H 2 O 2 ở mức 30%.
Nó được hiểu theo cùng một cách với phương thức porting object.
-Method với ống mao dẫn hoặc Fung và Petrishko
Đổ đầy ống mao quản 67 mm ở độ cao 20 mm bằng 3% hydro peroxide bằng mao quản.
Chạm vào thuộc địa bị cô lập mà bạn muốn học với mao quản chứa đầy 3% H 2 O 2 . Quan sát nếu mao quản chứa đầy bong bóng trong khoảng 10 giây. Phương pháp này cho phép bán định lượng phản ứng theo đường chéo:
Không có thánh giá thì không có bong bóng (phản ứng tiêu cực).
+ ---- Bong bóng nhỏ (phản ứng yếu hoặc chậm).
++ Bong bóng dồi dào (phản ứng vừa phải).
+++ - Bong bóng đạt đến cực độ ngược lại (phản ứng tràn đầy năng lượng).
Phương pháp -Taylor và Achanzar cho các xét nghiệm catalase gây nghi ngờ
Trên một phiến khô, sạch, đặt một thuộc địa biệt lập, sau đó đặt 0, 5% H 2 O 2 và che phủ bằng một lớp phủ. Quan sát xem có sự hình thành của bong bóng bị mắc kẹt hay không.
Giải thích: sự hiện diện của bong bóng cho thấy phản ứng tích cực. Không có bong bóng, nó được hiểu là một phản ứng tiêu cực.
Xét nghiệm Catalase cho các loài Mycobacterium
Kỹ thuật này cần được thực hiện bằng cách kiểm soát độ pH và nhiệt độ. Nó phải được chạy dưới mui xe dòng chảy, vì việc xử lý các loài Mycobacterium khác nhau là nguy hiểm.
-Chất liệu
Hydrogen peroxide ở mức 30% hoặc 110 thể tích (superoxal).
Dung dịch đệm PH 7
10% Tween 80
Nuôi cấy Mycobacterium nêm 3 đến 4 tuần
-Phân phối thuốc thử
Dung dịch đệm PH 7
Cân:
1, 361 g khan photphat đơn khan (KH 2 PO 4 ).
1, 420 g phân giải khan (Na2HPO3) phốt phát.
Hòa tan cả hai muối trong một ít nước cất vô trùng và hoàn thành với lượng nước tới 1000 ml.
10% Tween 80
Tạo độ pha loãng 1:10 cho Tween 80 được tập trung thương mại, vì vậy hãy tiến hành như sau:
Lấy 1 ml Tween 80 và đặt nó vào một ít nước cất, hòa tan và sau đó hoàn thành thể tích bằng nước đến 10 ml.
Thuốc thử cuối cùng
Trộn một lượng đệm phosphate với một lượng 10% Tween 80 (trong các phần bằng nhau). Xác định trong phòng thí nghiệm bạn muốn chuẩn bị bao nhiêu.
-Cung cấp
Đặt 5 ml dung dịch đệm phosphate vào ống nghiệm vô trùng có nắp vặn (Bakelite).
Với một vòng tiêm chủng, lấy đủ khuẩn lạc Mycobacterium được gieo hạt trong nêm và hòa tan trong đệm phosphate.
Che ống mà không thắt chặt quá nhiều. Đặt trong bồn nước ở 68 ° C trong 20 đến 30 phút. Hủy bỏ và để nguội ở 22-25 ° C
Đo 0, 5 ml thuốc thử cuối cùng (hỗn hợp) và thêm vào ống bằng dung dịch lạnh. Quan sát sự hình thành hay không của bong bóng.
Nó được giải thích như các kỹ thuật trước đây.
Sử dụng
Khi tăng trưởng khuẩn lạc trong môi trường được làm giàu, nhuộm Gram và xét nghiệm catalase phải được thực hiện trên các khuẩn lạc thu được. Điều này sẽ hướng dẫn các nhà vi trùng học về các thủ tục cần tuân thủ để xác định chính xác.
Kiểm soát chất lượng
Để đánh giá hoạt động đúng của thuốc thử hydro peroxide, hãy sử dụng các chủng đối chứng mới nuôi cấy, như Staphylococcus aureus làm đối chứng dương tính và các chủng Streptococcus sp làm đối chứng âm tính.
Một cách khác để kiểm soát tích cực là đặt một giọt hydro peroxide vào môi trường thạch máu, hồng cầu có catalase, do đó, sẽ có bọt khí nếu thuốc thử ở trong tình trạng tốt.
Một agar sô cô la có thể được sử dụng như một kiểm soát âm tính, ở đây hồng cầu đã bị ly giải và xét nghiệm là âm tính.
Hạn chế
-Không sử dụng các nền văn hóa cũ cho thử nghiệm, vì điều này có thể gây ra âm tính giả.
-Tránh lấy khuẩn lạc từ môi trường nuôi cấy trong môi trường thạch máu, nếu cẩn thận không chạm vào môi trường thạch; thủ tục này có thể gây ra dương tính giả, vì hồng cầu có chứa catalase.
-Nếu bạn lấy thuộc địa có tay cầm bằng bạch kim, đừng đảo ngược thứ tự của quy trình vì điều này có thể tạo ra dương tính giả. Điều này là do bạch kim có thể phản ứng với hydro peroxide, gây ra bong bóng.
-Không sử dụng thuốc thử hydro peroxide nếu quá cũ, vì thuốc thử này rất không ổn định và có xu hướng phân hủy theo thời gian.
-Giữ thuốc thử hydro peroxide được bảo vệ khỏi ánh sáng và trong tủ lạnh để tránh thiệt hại.
- Thực hiện kiểm soát chất lượng của thuốc thử hydro peroxide mỗi lần sử dụng.
- Hãy xem xét rằng nếu H 2 O 2 được sử dụng ở mức 30%, các phản ứng mạnh hơn so với phản ứng được thực hiện với 3% H 2 O 2 .
