Proteinase K: đặc điểm, hoạt động enzyme và ứng dụng

Proteinase K là một enzyme thuộc nhóm protease serine, nghĩa là, nó có ở trung tâm xúc tác hoạt động của nó là một serine axit amin và có chức năng phá vỡ liên kết peptide bằng cách thủy phân. Enzyme này, thuộc về họ protein Subilisin (peptidase S8).

Proteinase K có trọng lượng phân tử (MW) là 28.900 dalton và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1974 từ chiết xuất của album nấm Engyodontium, trước đây gọi là album Tritirachium Limber.

Nó thể hiện khả năng phân giải protein cao, được chứng minh là có thể làm giảm chất keratin có trong tóc. Từ keratin trong tiếng Anh được viết là "keratin", do đó nó được gọi là "proteinase K".

Do khả năng cao để tách protein bản địa, enzyme này rất hữu ích trong các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau. Nó chủ yếu được sử dụng để cô lập và điều chế axit nucleic có trọng lượng phân tử cao (MW).

Proteinase K hoạt động bằng cách giải phóng DNA hạt nhân, đồng thời phá hủy protein và làm bất hoạt RNase và DNase, nghĩa là loại bỏ các nuclease trong chế phẩm DNA và RNA.

Mặt khác, người ta đã thấy rằng proteinase K có thể thủy phân một số protein bản địa bị biến tính, điều này đã gây hứng thú cho các nhà nghiên cứu về việc sử dụng nó trong nghiên cứu về protein prion (PrP C).

Tuy nhiên, mặc dù có khả năng phân giải protein cao, vẫn có những protein kháng lại tác dụng của proteinase K. Trong số đó, có một số protein bất thường được gọi là prion (PrP Sc), liên quan đến bệnh não xốp dạng bọt truyền.

Đặc điểm của proteinase K

Proteinase K có cấu trúc bậc ba được hình thành bởi ba lớp, với một gồm bảy chuỗi xen kẽ giữa hai lớp xoắn ốc. Bởi vì nó thuộc họ peptidase S8, nó được đặc trưng bởi có bộ ba xúc tác trong vị trí hoạt động của nó, có thứ tự tuần tự là (Asp, His và Ser), phân biệt chúng với các họ peptidase khác.

Enzyme này từ nhóm protease serine được đặc trưng bằng cách thủy phân các liên kết peptide gần với nhóm carboxylic của axit amin aliphatic và thơm.

Mặt khác, nó có thể hoạt động với sự có mặt của một số chất ăn mòn, chẳng hạn như natri dodecyl sulfate (SDS), Tris-HCL và EDTA, được sử dụng để giúp làm biến tính protein, khiến chúng mất cấu trúc tự nhiên.

Đây là bước đầu tiên trong quá trình chuẩn bị protein cho kỹ thuật điện di. Phạm vi pH mà proteinase K hoạt động khá rộng (2.0 đến 12.0), với độ pH tối ưu trong khoảng từ 7, 5 đến 12, 0 và điểm đẳng điện của nó là 8, 9. Có thể thấy, nó hoạt động chống lại phạm vi pH rất rộng.

Một đặc điểm khác nổi bật trong proteinase K là tính ổn định của nó khi có nhiệt độ cao (50 - 60 ° C).

Hoạt động men

Proteinase K cần sự hiện diện của ion canxi, mặc dù điều này không ảnh hưởng đến hoạt động của nó, nếu nó là điều cần thiết để duy trì sự ổn định của nó.

Để proteinase K thực hiện quá trình tiêu hóa hoàn toàn cơ chất, thời gian tiếp xúc gần đúng trong khoảng từ 5 phút đến 2 giờ là cần thiết.

Tuy nhiên, theo nghĩa này, Daza và cộng sự đã so sánh độ tinh khiết của DNA thu được ở các thời điểm tiếp xúc với proteinase K khác nhau và kết luận rằng việc ủ bệnh kéo dài (lên đến 24 giờ) giúp cải thiện đáng kể chất lượng DNA.

Bây giờ, liên quan đến nồng độ được sử dụng của enzyme proteinase K trong các giao thức khác nhau, có thể nói rằng nó rất đa dạng.

Nó có thể được sử dụng từ nồng độ rất thấp (5 g / ml) đến nồng độ 500 g / ml. Nhưng nồng độ công việc thường xuyên nhất nằm trong khoảng từ 50-100μg / ml, đặc biệt đối với quá trình tiêu hóa protein và bất hoạt nuclease. Mặc dù nồng độ 2 mg / ml là cần thiết để điều trị mô.

Ứng dụng

Các ứng dụng của nó rất rộng và có thể được tóm tắt như sau:

-Nó được sử dụng trong quá trình tiêu hóa protein và chiết xuất DNA bằng một số phương pháp như: khử muối, PK-SDS, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), kali axetat biến tính và chiết xuất bằng natri iodua.

-Không hoạt động của các nuclease (RNase và DNase).

-Trong kỹ thuật lai tại chỗ (NGA), để giúp giải phóng axit nucleic, ngoài việc loại bỏ các protein không mong muốn.

-Sự biến đổi protein.

-Tại cấp độ nghiên cứu, trong các nghiên cứu khác nhau.

Ưu điểm của proteinase K

Một số nghiên cứu so sánh đã được thực hiện giữa các kỹ thuật trích xuất DNA bằng Proteinase K, với những nghiên cứu khác không sử dụng và tất cả đều kết luận rằng có những lợi ích lớn hơn khi sử dụng enzyme. Trong số các ưu điểm, có thể đề cập đến:

- DNA có trọng lượng phân tử cao, chất lượng cao và độ tinh khiết thu được.

-Các DNA chiết xuất ổn định đến 3 tháng.

DNA chiết xuất có thể được sử dụng trong các kỹ thuật sau: Nam blot, phản ứng chuỗi polymerase (PCR), điện di, trong số các kỹ thuật khác.

Protein kháng proteinase K

Một số nghiên cứu đã kết luận rằng prion (protein độc hại PrPSc bất thường) được phân biệt với protein PrPC (bản địa) vì chúng chống lại tác động của proteinase K, trong khi PrPC nhạy cảm với hành động của chúng.

Các tác giả khác đã mô tả rằng trong cấu trúc của PrPSc có những phần nhạy cảm và những phần khác kháng với proteinase K. Tuy nhiên, cả hai phần đều độc hại và nhiễm trùng như nhau.

Mặt khác, Bastian và cộng tác viên năm 1987 đã phân lập được 4 protein gồm 28, 30, 66 và 76 kda từ một loài Spiroplasma mirum . Tất cả đều chống lại tác dụng của proteinase K và cũng phản ứng chéo với một số prion.

Được biết, loài này có thể gây đục thủy tinh thể và tổn thương thần kinh quan trọng và do những phát hiện khoa học của Bastian, trong số các nghiên cứu khác, một nỗ lực đã được thực hiện để liên kết vi sinh vật này với bệnh não xốp truyền bệnh.

Tuy nhiên, nguyên nhân của bệnh lý thần kinh thoái hóa này vẫn được quy cho prion.

Theo nghĩa này, Butler và cộng tác viên vào năm 1991 đã xác định và mô tả một lớp protein kháng 40 Kda proteinase từ hai chủng Mycoplasma hyorhinis. Tác nhân gây bệnh này ảnh hưởng đến lợn, lây nhiễm các mô của chúng, nhưng trong trường hợp này không có phản ứng chéo với prion được thử nghiệm.

Cần nhiều nghiên cứu hơn để làm sáng tỏ nhiều điều chưa biết về nó.